유전 질환은 여전히 전 세계적인 과제입니다. 이는 유전자의 돌연변이로 인해 개인의 생물학적 기능, 대사 과정 또는 특정 필수 단백질의 생성에 영향을 받아 다양한 유전적 질환을 유발하기 때문입니다. 유전자 치료제는 특정 유전자를 표적으로 삼아 이를 복구하거나 수정하고 세포가 기능적 단백질을 생성하거나 질병을 유발하는 유전자 결함에 개입할 수 있는 새로운 지침을 제공하는 치료적 개입의 한 유형입니다.
일반적인 유전자 약물에는 주로 DNA와 RNA가 포함되며, DNA는 치료 효과가 있는 유전자 단편 또는 유전자 서열일 수 있습니다. 이러한 DNA는 세포에 전달되어 결함이 있거나 없는 유전자 기능을 대체하거나 보완합니다. RNA는 메신저 RNA(mRNA), 소형 간섭 RNA(siRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO) 등일 수 있으며, 이는 유해한 유전자의 발현을 수정, 억제하거나 특정 유전자의 기능을 회복하는 데 사용할 수 있습니다.
그러나 DNA와 RNA는 모두 인체에 들어가 표적 세포에 도달하는 데 많은 어려움에 직면합니다. 유전자 서열은 위장관에서 불안정하기 때문에 일반적으로 정맥 주사 또는 피하 주사로 투여하지만, 그렇더라도 대부분의 유전자 서열은 여전히 인체의 풍부한 뉴클레아제에 의해 분해됩니다.
소량의 잔류 유전자 약물이 표적 세포 외부에 도달하면 유전자 서열은 음전하를 띠는 인산기가 있는 큰 분자이고 세포막도 음전하를 띠기 때문에 세포에 들어갈 수 없습니다. 두 개의 음전하가 만나면 유전자는 밀려나 세포에 들어갈 수 없습니다. 따라서 우리는 생체 내 분해를 방지하고 세포막 침투 효율을 높이고 DNA 또는 RNA 서열을 세포에 원활하게 전달하는 특정 유전자 약물 전달 방법을 개발해야 합니다.
유전자 약물의 전달 방법
현재 일반적인 유전자 전달 방법은 주로 바이러스 벡터 전달과 비바이러스 벡터 전달의 두 가지 범주로 나뉩니다. 바이러스 벡터 전달에는 주로 아데노 연관 바이러스(AAV) 및 렌티바이러스 등이 포함되어 있으며, 이는 숙주 세포의 바이러스 감염 과정을 시뮬레이션하고 세포 장벽을 쉽게 통과하여 높은 전달 효율을 달성할 수 있습니다. 그러나 바이러스 벡터 전달에는 문제가 있습니다. 첫째, AAV의 최대 패키징 용량이 4.7kb인 것과 같이 패키징 용량이 제한되어 더 긴 유전자 시퀀스를 전달할 수 없습니다. 둘째, 바이러스 벡터는 세포 면역 및 체액 면역을 포함한 심각한 면역 반응을 일으킬 수 있어 임상 적용에 위험을 초래할 수 있습니다. 이와 비교할 때 비바이러스 벡터는 안전성과 약물 적재 용량 측면에서 엄청난 이점이 있습니다.
현재 일반적으로 사용되는 비바이러스 벡터에는 주로 리포좀, 폴리머, 나노입자, 엑소좀 등이 있으며, 그 중 리포좀은 직경이 100nm에서 1um에 이르는 양친매성 분자로 형성된 소포입니다. 이들은 주로 인지질, 콜레스테롤, PEG 지질 및 양이온성 지질로 구성됩니다. 인지질 이중층 구조는 세포막과 유사하며 세포 내포작용을 통해 원활하게 세포로 들어갈 수 있습니다. 또한 리포좀은 신체의 면역 청소를 피하면서 특정 조직이나 세포를 표적으로 삼기 위해 표면의 PEG 또는 특정 항체를 변형할 수도 있습니다. 양이온성 리포좀은 양전하를 띤 4차 암모늄염 지질을 함유한 리포좀으로, 음전하를 띤 핵산 약물과 더 잘 결합하고 전달 시스템의 안정성을 유지할 수 있습니다. 따라서 리포좀은 유전자 약물을 위한 일반적인 비바이러스 벡터 전달 방법 중 하나입니다.
그러나 전통적인 리포좀도 몇 가지 문제점이 있습니다. 첫째, 리포좀 직경의 범위가 넓기 때문에 충분한 약물 적재 용량을 보장할 수 있지만 리포좀이 혈관 내피 틈(100-200nm)을 통과할 때 크기가 너무 크면 이 과정을 방해합니다. 또한 리포좀이 세포 내포작용을 통해 세포에 들어가 엔도좀-리소좀 시스템을 형성한 후 전통적인 리포좀은 제때 리소좀 탈출을 완료할 수 없어 대부분의 유전자 약물이 리소좀에 의해 분해되어 효과를 발휘할 수 없습니다. 유전자 약물을 전달하는 전통적인 리포좀의 이러한 단점을 바탕으로 지질 나노입자(LNP)가 개발되어 특히 표적 세포와 조직에 핵산을 전달하는 데 적합한 중요한 전달 방법이 되었습니다.
LNP 캐리어 시스템 소개
지질 나노입자(LNP)는 지질과 유사한 물질로 구성된 나노입자이며 일반적으로 10-200nm 사이의 직경을 가지고 있습니다. 전통적인 리포좀과 비교했을 때, 이들은 더 작고 혈관 내피 틈을 통과하기 쉽습니다. 또한, LNP는 일반적으로 양이온성/이온화 가능한 지질, 보조 인지질, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 지질 및 콜레스테롤로 구성됩니다. 그 중, 보조 인지질과 콜레스테롤은 LNP의 안정성을 증가시킬 수 있습니다. PEG 지질은 생체 내 LNP의 순환 시간을 증가시키고 면역 반응을 줄이는 데 도움이 됩니다. 이러한 성분은 전통적인 리포좀과 유사한 기능을 가지고 있습니다. 차이점은 양이온성/이온화 가능한 지질에 있으며, 이는 또한 LNP에 대한 특허 보호의 주요 영역입니다.
앞서 언급했듯이, 양이온성 리포좀은 핵산 약물과의 결합을 효과적으로 유지하고 핵산 약물의 전달 효율을 개선할 수 있습니다. 그러나 양이온성 리포좀은 또한 신체 순환에서 음전하를 띤 혈장 단백질, 혈액 세포 등과 비특이적으로 결합하기 쉽고, 리포좀 응집을 일으키고 신체에서 빠르게 제거됩니다(생체 내 양이온성 리포좀의 반감기는 15분에 불과합니다).
이 문제를 해결하기 위해 연구자들은 이온화 가능한 지질이라는 새로운 유형의 지질 물질을 개발했습니다. 이온화 가능한 지질은 구조상 양이온성 지질과 매우 유사합니다. 일반적인 양이온성 지질 DOTAP과 이온화 가능한 지질 DODAP를 예로 들면, 차이점은 DOTAP가 양전하를 띤 4차 암모늄염인 반면 DODAP는 3차 아민 구조라는 것입니다. 3차 아민 구조는 지질의 pKa를 6-7 사이로 유지할 수 있습니다. pH가 pKa보다 낮으면(산성 조건에서) 이온화 가능한 지질은 양전하를 띱니다.
pH가 pKa에 가까울 때(중성 조건 하에서), 이온화 가능한 지질은 중성입니다. 이 설계는 양이온성 리포좀이 겪는 문제를 교묘하게 해결할 수 있습니다. 혈액 순환의 pH가 중성에 가까우므로 이온화 가능한 지질도 중성이며, 혈장 단백질이나 혈액 세포 간의 비특이적 결합이 상당히 감소하여 반감기가 늘어납니다. 또한, 이온화 가능한 지질 LNP가 세포에 의해 흡수되어 리소좀에 들어가면 지질은 이온화되고 pH가 5-6인 리소좀 환경에서 양전하를 띱니다. 양전하를 띤 지질은 엔도솜-리소좀 막과 쉽게 융합되어 리포좀이 세포질로 빠져나가 핵산을 분리하고 방출하여 효과를 발휘합니다. 요약하자면, LNP 캐리어 시스템을 설계하려면 지질 구성, 입자 크기, 표면 전하 및 안정성을 최적화하여 효율적인 유전자 전달을 달성해야 합니다.
LNP 패키지 유전자 약물을 위한 LCMS 생물 분석 전략
LNP-패키징된 유전자 약물은 주로 LNP 쉘과 유전자 약물 자체로 구성됩니다. LNP 쉘은 주로 지질 성분(양이온성/이온화 가능한 지질이 약 30-50%, PEG 지질이 약 2%, 콜레스테롤이 약 20-50%, 보조 인지질이 약 10-20%를 차지함)으로 구성되는 반면, 유전자 약물은 주로 유전자 서열 단편(DNA, ASO, siRNA 및 miRNA 등)으로 구성됩니다. NMPA 및 FDA[14-15]의 최신 규정에 따르면 LNP와 같은 약물 전달 시스템 약물의 IND 신청을 위해서는 활성 성분(유전자 서열)에 대한 약리학적 및 약동학적 연구를 수행하는 것 외에도 약물 전달 시스템에서 시판되는 약물에 사용되지 않은 새로운 지질 성분(예: 양이온성/이온화 가능한 지질 및 LNP에 특수 변형이 있는 PEG 지질)에 대한 안전성 및 약리적 평가도 필요합니다.
LNP 지질의 LCMS 생물분석은 양이온성/이온화 가능한 지질과 PEG 지질에 초점을 맞춥니다. 이들 간의 구조적 차이로 인해 양이온성/이온화 가능한 지질 분자량은 일반적으로 1kDa 이내인 반면, PEG 지질 분자량은 변형기를 지닌 후 2~5kDa에 도달할 수 있어 이들 간의 크로마토그래피 유지 및 질량 분석 반응에 큰 차이가 발생합니다. LNP의 양이온성/이온화 가능한 지질 함량이 PEG 지질보다 높다는 점을 고려할 때, 반응 차이로 인해 두 지질의 전처리 방법(추출 용매 선택, 희석 인자 결정)을 효과적으로 통합할 수 없습니다. 또한 PEG 지질의 피크 위치 주변에 많은 간섭 피크가 존재하기 때문에 효과적인 분리를 위해 더 긴 액상 분리 구배가 필요한 경우가 많으며, 이는 높은 분석 효율을 보장할 수 없습니다. 따라서 생물분석에서 PEG 지질 검출 방법을 별도로 확립합니다. 동시에, 양이온성/이온화 가능 지질과 PEG 지질은 지질 성분으로 인해 분석법 개발에 공통적인 어려움이 있습니다. 즉, 물에 대한 용해도가 낮고, 생물학적 기질에서 불안정하며, 단백질 결합으로 인해 회수율이 한계를 초과하고, PEG 지질의 간섭 및 잔류물이 많고, 실제 샘플 기질에서 지질의 안정성이 변화하며, 내부 표준을 선택하기 어려운 등의 어려움이 있습니다.
